Диагностика малярии основана на данных клинических проявлений, эпидемиологического расследования и лабораторных методах исследования, включающих методики выявления паразитов, их количества, видовую принадлежность и обнаружение антител в организме исследуемого. Обследованию в первую очередь подлежат пациенты из группы риска — прибывшие из эндемичных по малярии регионов, лихорадка у которых появилась в первые два года после выезда из этих регионов.
Рис. 1. Забор крови для приготовления препарата «толстая капля».
Рис. 2. Окраска и вид препаратов «толстая капля» и тонкий мазок.
Диагностика малярии с использованием микроскопического метода
Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка, позволяющая обнаружить паразитов, их количество и видовую принадлежность, является ведущим методом диагностики малярии. Она проводится при малейшем подозрении на это заболевание, независимо от температурной реакции пациента. Для определения видовой принадлежности паразитов и стадии заболевания используется тонкий мазок крови. В толстой капле локализуется больше паразитов, чем в мазке. Этот метод диагностики превосходит методику определения наличия возбудителей малярии в тонком мазке крови в 20 — 40 раз.
В периферической крови паразиты обнаруживаются через определенное время после заражения:
при 3-х дневной малярии — через 8 — 12 дней,
при тропической — от пяти с половиной дней до 12,
при 4-х дневной — через 15 — 21 день,
при малярии, подобной 3-х дневной — через 9 — 15 дней.
Паразиты в крови присутствуют как во время лихорадочного приступа, так и в межприступный период и при паразитоносительстве.
Рис. 3. Техника приготовления тонкого мазка.
Техника приготовления «толстой» капли
Полученная при проколе пальца капля крови наносится на предварительно очищенное и сухое предметное стекло и размазывается до получения пятна 1 см в диаметре. После подсушивания на воздухе предметное стекло заливается краской Романовского—Гимзы. По истечении 40-минутной экспозиции препарат ополаскивается под проточной водой и подсушивается при комнатной температуре, установленный в вертикальное положение.
Под микроскопом исследуется не менее 100 полей зрения. Более эффективным считается исследование 2-х толстых капель в течение 2,5 минут, чем 1-й капли в течение 5-и минут. 100 полей зрения просматриваются даже в том случае, когда малярийные плазмодии выявились уже в первых полях. Это производится для того, чтобы не пропустить микст-инфекцию.
Рис. 4. Микроскопия препарата «толстая капля» и тонкого мазка является ведущим методом диагностики малярии.
Порог обнаружения паразитов
Порогом обнаружения малярийных плазмодиев называется минимальная концентрация возбудителей, которую возможно выявить при микроскопировании препарата «толстая капля». При заболевании этот показатель составляет 5 паразитов в одном микролитре крови. При просмотре 100 полей зрения обследуется 0,2 мкл крови.
При наличии косвенных признаков малярии (пребывание в эндемичных зонах, гипохромная анемия, обнаружение пигмента в моноцитах) и отрицательных результатов исследования препаратов «толстая капля», исследование вновь повторяется более тщательно, и не одно, а серия, состоящая из 4 — 6 препаратов при одном уколе, либо полученных при заборе крови, который производится 4 — 6 раз в сутки в течение 2 — 3 дней.
Интенсивность паразитемии определяется знаком «+».
1 (+) обозначает выявление от 1 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 5 — 50 плазмодиям в одном мкл крови;
2 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 10 п/зр, что соответствует 50 — 500 плазмодиям в одном мкл крови;
3 (+) обозначает выявление от 1 до 10 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 500 — 5000 плазмодиям в одном мкл крови;
4 (+) обозначает выявление от 10 до 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует 5000 — 50000 плазмодиям в одном мкл крови;
5 (+) обозначает выявление более 100 паразитов в 1 п/зр, что соответствует более 50000 плазмодиям в одном мкл крови.
Интенсивность паразитемии можно вычислить по количеству паразитов на 100 эритроцитов в 10 полях зрения, либо по соотношению числа паразитов и лейкоцитов в 1 мкл крови.
По интенсивности паразитемии определяется прогноз при тропической малярии. При других видах заболевания более 2% эритроцитов не поражается.
Формы малярийных плазмодиев в разные фазы развития
В препарате крови «толстая капля» возможно определить плазмодии малярии, находящиеся на разных стадиях развития — трофозоида, кольца, шизонта, морулы, и гаметы.
Рис. 5. Plasmodium ovale имеет округлую форму.
Рис. 6. Молодой трофозоит Plasmodium vivax в эритроците.
Рис. 12. Гаметоциты плазмодий тропической малярии имеют полулунную форму, плазмодии других видов заболевания — округлую.
Рис. 13. В процессе роста в цитоплазме паразитов накапливается пигмент. На фото Р. vivax.
Контроль эффективности лечения
При адекватном лечении малярии уровень паразитемии в течение суток снижается на 25% и более, а через 3 суток от начала лечения он должен составлять не более 25% от исходного. В случае обнаружения паразитов на 4-е сутки от начала лечения свидетельствует о развитии лекарственной резистентности возбудителей.
Кратность проведения исследования
При выявлении малярии микроскопическое исследование препаратов крови проводится ежедневно. При тяжелой форме тропической малярии микроскопия проводится 2 раза в день до исчезновения возбудителей в крови и далее еженедельно до 28 дня лечения с целью оценки его эффективности и выявления резистентности к противомалярийным препаратам.
Рис. 14. Эритроциты при инфицировании P. vivax и P. ovale увеличиваются, обесцвечиваются и деформируются, в них появляется токсическая зернистость.
При инфицировании P. malariae и P. falciparum форма и размеры эритроцитов не изменяется. На фото деформированные эритроциты больного малярией (микрофотография в сканирующем микроскопе).
С помощью серодиагностики малярии возможно выявить в сыворотке крови пациента антитела и растворимые паразитарные антигены. Серологические реакции показаны к применению в случаях появления у больных лихорадки неясного генеза, гепатоспланомегалии, анемии, а также для исследования крови донора — предполагаемого источника инфекции. Серологические реакции применяются при эпидемиологическом наблюдении за лицами, проживающими в неблагополучных по малярии в прошлом территориях.
Чаще всего при диагностике малярии применяется НРИФ — непрямая реакция иммунофлуоресценции. Используются так же ИФА, РИГА и др. Внедряется в практику использование реакции энзим-меченых антител (РЭМА).
В случаях очень низкой паразитемии показано применение ПЦР (полимеразной цепной реакции). Дороговизна и сложность применения данной методики не позволяет широко ее использовать.
Разработаны новые методы диагностики малярии — экспрессного микроскопического анализа препаратов крови с использованием флюоресцирующих красителей, позволяющие в течение двух минут выявить паразитов тропической малярии, количество которых более 60 в 1 мкл гемолизированой крови.
При малярии антитела появляются на 8 — 27 день паразитемии. Первыми появляются антитела IgM, затем — антитела IgG. Антитела после перенесенной малярии и успешного излечения могут длительно сохраняться в крови человека — от 0,5 до 2 и даже 20 лет.
Рис. 15. Чаще всего при диагностике малярии применяется НРИФ — непрямая реакция иммунофлуоресценции.
