Testování na syfilis je jedním z nejběžnějších laboratorních testů. Testy na syfilis se hojně využívají při preventivních prohlídkách. Pomocí mikroskopie je identifikován původce syfilis – Treponema pallidum.Pomocí sérologických reakcí je potvrzena diagnóza syfilis, stanovena diagnóza latentní syfilis, monitorována účinnost léčby a stanovena vyléčení pacientů.
Diagnóza syfilis je stanovena na základě klinických údajů, detekce patogenů syfilis ve vzorcích materiálu a potvrzení diagnózy sérologickými výzkumnými metodami. Projevy syfilis jsou četné a rozmanité, proto je toto onemocnění diagnostikováno lékaři různých specializací. Diferenciální diagnostika primární syfilis se provádí s řadou onemocnění.
Rýže. 1. Na fotografii je primárním projevem syfilis chancre.
Protilátky proti Treponema pallidum a sérologická diagnostika
Při infekci syfilisem se v těle pacienta tvoří protilátky. Sérologická diagnostika pomáhá lékaři studovat dynamiku tvorby protilátek v těle pacienta se syfilidou v počátečních stádiích onemocnění, během léčby a po jejím ukončení, řešit otázku relapsu onemocnění u pacienta nebo reinfekce (reinfekce), k diagnostice syfilis u masových zdravotních stavů.
Protilátky proti Treponema pallidum IgM
Po infekci se jako první tvoří protilátky IgM. Začínají být detekovány pomocí sérologických reakcí od druhého týdne po infekci. Po 6–9 týdnech nemoci se jejich počet stává maximálním. Pokud pacient není léčen, protilátky po šesti měsících vymizí. IgM protilátky vymizí po 1 - 2 měsících. po léčbě časné syfilis, po 3 - 6 měsících. - po léčbě pozdní syfilis. Pokud je zaznamenán jejich růst, je to známka relapsu syfilis nebo indikuje opětovnou infekci. Molekuly IgM jsou velké a neprocházejí placentou k plodu.
Protilátky proti Treponema pallidum IgG
IgG imunoglobulinové protilátky se objevují na konci prvního měsíce (4. týden) od okamžiku infekce. Jejich titr je vyšší než titr IgM. IgG přetrvává po léčbě poměrně dlouho.
Nespecifické protilátky
Existuje mnoho sérologických reakcí. To je vysvětleno antigenní multiplicitou Treponema pallidum. V krevním séru nemocného v různých stádiích syfilis se kromě specifických tvoří i určité nespecifické protilátky - aglutininy, komplement-fixující, imobilisiny, protilátky způsobující imunitní fluorescenci, precipitiny atd. Sérologické reakce k průkazu nespecifických protilátek mít relativní specifičnost, abyste se vyhnuli diagnostickým chybám, neměli byste používat pouze jednu, ale komplex sérologických reakcí (SRR).
Falešně pozitivní testy na syfilis
Charakteristickým rysem netreponemových testů je příjem falešně pozitivních reakcí. Protilátky-reaginy, které jsou produkovány v lidské krvi proti kardiolipinovému antigenu, jsou zaznamenány nejen u syfilis, ale i u dalších onemocnění: kolagenóza, hepatitida, onemocnění ledvin, tyreotoxikóza, rakovina, infekční onemocnění (lepra, tuberkulóza, brucelóza, malárie, tyfus, spála), během těhotenství a menstruačních cyklů, při konzumaci tučných jídel a alkoholu. Bylo zaznamenáno, že počet falešně pozitivních reakcí se zvyšuje s věkem.
Rýže. 2. Fotografie ukazuje primární syfilis u žen.
Laboratorní diagnostika syfilis pomocí sérologických testů
Sérologické testy na syfilis se dělí na treponemální a netreponemální.
1. Netreponemální testy
Antigen používaný v této skupině testů je kardiolipinový antigen. Nejpočetnější jsou lipidové antigeny patogenů syfilis. Tvoří 1/3 suché hmoty buňky. Pomocí netreponemálních testů jsou detekovány reaginové protilátky, které jsou produkovány proti kardiolipinovému antigenu. Do této skupiny patří komplement fixační test (FFR), mikroprecipitační test (MPR), rapid plasma reagin test (RPR) atd. Pomocí netreponemálních testů se provádí primární screening na syfilis (průzkum populačních skupin) a možnost získání výsledků v kvantitativní formě umožňuje použití těchto testů ke sledování účinnosti léčby. Pozitivní výsledky netreponemálních testů musí být potvrzeny treponemálními testy. Charakteristickým rysem netreponemových testů je příjem falešně pozitivních reakcí.
2. Treponemální testy
Treponemální testy používají antigeny treponemového původu izolované z kultury Treponema pallidum. S jejich pomocí se potvrzují pozitivní výsledky netreponemových testů. Do skupiny patří: RSKtrep - reakce fixace komplementu, RIF - imunofluorescenční reakce a její modifikace, RIT, RIBT - imobilizační reakce Treponema pallidum, RPHA - pasivní hemaglutinační reakce, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay.
3. Testy na syfilis pomocí rekombinantních antigenů
Antigeny pro tuto skupinu testů jsou získávány genetickým inženýrstvím a používají se v reakcích - RPGA a ELISA, v imunoblotovacích (IB) analýzách a imunochromatografických analýzách.
Rýže. 3. K diagnostice syfilis se používá soubor sérologických testů.
K detekci syfilis se používají netreponemální testy nebo komplex sérologických reakcí (SSR). Sérologická diagnostika se používá od 5. týdne od okamžiku infekce nebo od 2-3 týdnů po objevení se chancre. Protilátky jsou detekovány téměř u všech pacientů s čerstvou primární, sekundární a recidivující syfilis. Sérologické reakce jsou pozitivní u 70 - 80 % pacientů s terciární aktivní syfilis, v 50 - 60 % případů u pacientů s terciární latentní syfilis.
Sérologické testy využívající netreponemální testy mohou poskytnout falešně pozitivní výsledky.
Reakce fixace komplementu (karta RSK, KSK s KA, Wassermanova reakce)
Wassermanova reakce (RW, РВ), vynalezená A. Wassermanem před více než 100 lety, dnes prošla mnoha změnami, ale jako pocta tradici si své jméno zachovala až do současnosti. Reakce fixace komplementu pomocí kardiolipinového antigenu je určena nejen k průkazu protilátek, ale je prováděna i kvantitativně – s různým ředěním séra, což umožňuje její využití pro sledování účinnosti léčby. Negativními aspekty tohoto typu studie jsou nízká senzitivita a specificita, získávání falešně pozitivních výsledků.
Podstata Wassermanovy reakce je následující: antigeny, které se používají ke stádiu Wassermanovy reakce, se na ně v případě přítomnosti protilátek proti původcům syfilis v lidské krvi navážou komplimentem a vysrážejí se. Intenzita reakce je označena znaménkem (+).Reakce může být negativní (-) - bez sedimentu, pochybná (malý sediment nebo +), slabě pozitivní (++), pozitivní (+++) a silně pozitivní (++++).
Modifikovaná Wassermanova reakce, Kolmerova reakce, je citlivější. S jeho pomocí jsou protilátky detekovány v sérech, kde Wassermanova reakce poskytla negativní výsledek.
V případě ostře pozitivních reakcí se provádí kvantitativní stanovení reaginů, pro které se používá sérum v ředění od 1:10 do 1:320, což umožňuje použití tohoto typu studie ke sledování účinnosti léčby. Například pokles titru protilátek a jejich následná séronegativita (získání negativních výsledků) svědčí o úspěšném vyléčení onemocnění.
Rýže. 5. Krevní test na syfilis - Wassermanova reakce.
Mikroprecipitační reakce (MPR)
Srážková mikroreakce se využívá pro hromadná vyšetření určitých skupin populace, diagnostiku syfilis a sledování účinnosti léčby. K provedení tohoto typu výzkumu je zapotřebí malé množství testovacího materiálu. Mikroreakce precipitace je založena na imunologické reakci antigen-protilátka. Pokud jsou protilátky přítomny v krevním séru subjektu, komplex antigen-protilátka se vysráží za vzniku vloček. Reakce se provádí v jamkách speciální skleněné desky. Posuzuje se podle intenzity sraženiny a velikosti vloček v (+) jako Wassermanova reakce. Nepoužívá se při vyšetřování těhotných žen, dárců a ke sledování účinnosti léčby. VDRL a RPR jsou typy mikroreakcí.
Rýže. 6. Typ srážecí reakce v kapce na skle.
Rýže. 7. Krevní test na syfilis - mikroprecipitační reakce.
Rýže. 8.Souprava pro rychlé stanovení plazmatických reaginů (RPR test na syfilis).
Všechny pozitivní testy získané při nespecifických sérologických reakcích vyžadují potvrzení specifickými reakcemi – treponemálními testy.
Při provádění treponemových testů se používají antigeny treponemového původu. Jejich negativní stránkou je nemožnost jejich použití ke sledování účinnosti léčby, získání pozitivních výsledků u spirochetóz a nevenerických treponematóz a získání falešně pozitivních výsledků u onkologických onemocnění, lepry a některých endokrinních patologií. Testy jako RPGA, ELISA a RIF zůstávají pozitivní po mnoho let po vyléčení syfilis a v některých případech po celý život.
RIBT a RIF jsou nejspecifičtější ze všech sérologických reakcí používaných k diagnostice syfilis. Umožňují rozlišit falešně pozitivní reakce a identifikovat pozdní formy syfilis, které se vyskytují s negativními reakcemi. Pomocí RIBT jsou rozpoznány falešně pozitivní reakce u těhotných žen, když je nutné vyřešit problém infekce dítěte.
Treponema pallidum imobilizační reakce (RIBT, RIT)
Podstatou reakce je, že protilátky v krevním séru pacienta znehybňují Treponema pallidum. Reakce je považována za negativní, když je imobilizováno až 20 % patogenů, slabě pozitivní - 21 - 50 %, pozitivní - 50 - 100 %. RIBT někdy dává falešně pozitivní výsledky.Test je komplexní a pracný, je však nepostradatelný při diferenciální diagnostice latentních forem onemocnění a falešně pozitivních výsledků sérologických reakcí, a to i u těhotných žen. RIBT dává 100% pozitivní výsledek pro sekundární, časnou a pozdní syfilis, v 94 - 100% případů - pro jiné formy syfilis.
Imunofluorescenční reakce (RIF)
Podstata reakce spočívá v tom, že treponema pallidum (antigeny) v kombinaci s protilátkami značenými fluorochromy vydávají ve fluorescenčním mikroskopu žlutozelenou záři. Výsledek se vyhodnotí znaménkem (+). Pomocí RIF jsou detekovány imunoglobuliny třídy A. Imunofluorescenční reakce se stává pozitivní dříve než Wassermanova reakce. Vždy je pozitivní u sekundární a latentní syfilis, v 95 - 100 % případů je pozitivní u syfilis terciární a vrozené. Technika provádění tohoto typu výzkumu je jednodušší než technika RIBT, ale není možné nahradit RIF RIBT, protože tato reakce je ve specifičnosti nižší než RIBT. RIF-10 (modifikace RIF) je citlivější, RIF-200 a RIF-abs jsou specifičtější.
Rýže. 9. Krevní test na syfilis - imunofluorescenční reakce (RIF).
Treponema pallidum imunitní adhezní reakce (IPAT)
Podstatou reakce je, že treponema pallidum senzibilizovaný sérem pacienta v přítomnosti komplementu přilne na povrch červených krvinek. Výsledné komplexy se vysrážejí během centrifugace. Senzitivita tohoto testu a specificita jsou blízké RIF a RIBT.
Enzymový imunotest na syfilis (ELISA)
Pomocí ELISA jsou stanoveny imunoglobuliny třídy M a G Technika IgM - ELISA může být použita jako screeningový a konfirmační test.Senzitivita ELISA a její specificita jsou podobné RIF. U syfilis dává ELISA pozitivní výsledky od třetího měsíce infekce a zůstává pozitivní po poměrně dlouhou dobu (někdy po celý život).
Rýže. 10. Analyzátor enzymové imunoanalýzy.
Pasivní (nepřímá) hemaglutinační reakce (RPHA)
RPHA je založena na schopnosti červených krvinek, na kterých jsou adsorbovány antigeny treponema pallidum, slepit se (hemaglutinace) v přítomnosti séra pacienta. RPGA se používá k diagnostice všech forem syfilis, včetně latentní. Při použití vysoce kvalitního antigenu tento typ sérologické reakce předčí ve specificitě a senzitivitě všechny ostatní testy.
Rýže. 11. RPGA se používá k diagnostice všech forem syfilis.
Rýže. 12. Test na syfilis - pasivní (nepřímá) hemaglutinační reakce (schéma).
Rýže. 13. Vzhled obráceného deštníku, který zabírá celé dno zkumavky, ukazuje na pozitivní reakci. V případě, že se červené krvinky usadí ve sloupci („tlačítko“) ve středu dna zkumavky, je indikována negativní reakce.
Spolu se sérologickou diagnostikou hraje důležitou roli metoda průkazu Treponema pallidum (mikrobiologická diagnostika), zejména v období séronegativní syfilis, kdy v krvi ještě nejsou žádné protilátky, ale již se objevují první projevy čerstvé primární syfilis ( venerologický vřed).
Biologickým materiálem pro studium je výtok z povrchu tvrdých vředů (chancres), obsah pustulárních syfilidů, mokvavé a erozivní papuly, punkce infikovaných lymfatických uzlin, mozkomíšní mok a plodová voda pro PCR - krev.
Nejlepší metodou pro detekci patogenů syfilis je zkoumání biologického materiálu v mikroskopu v tmavém poli. Tato technika umožňuje vidět treponema pallidum v živém stavu, studovat jeho strukturální rysy a pohyb a rozlišovat patogenní patogeny od saprofytů.
Rýže. 15. Analýza na syfilis - mikroskopie v tmavém poli.
Rýže. 16. Při studiu suchých nátěrů se používá barvení Romanovsky-Giemsa. Světlé treponémy se zbarvují do růžova, všechny ostatní druhy spirochet se zbarvují do fialova.
Detekce Treponema pallidum mikroskopií v tmavém poli je absolutním kritériem pro konečnou diagnózu syfilis.
Rýže. 17. K identifikaci bakterií se používá imunofluorescenční reakce (RIF) - treponemální test. Specifický komplex antigen-protilátka v kombinaci se specifickým sérem značeným fluorochromem ve světle fluorescenčního mikroskopu dodává bakteriím nazelenalou záři.
Rýže. 18. Původci syfilis jsou jasně viditelní v nátěrech připravených metodou Levaditi (impregnace stříbrem). Bledý treponema je tmavé barvy na pozadí žluté barvy buněk infikovaných tkání.
Rýže. 19. Původce syfilis při vícenásobném zvětšení.
Rýže. 20. Fotografie ukazuje kolonii Treponema pallidum. Je obtížné získat bakteriální kulturu. Na umělých živných půdách prakticky nerostou. Na médiu obsahujícím koňské a králičí sérum se kolonie objevují ve dnech 3–9.
Dnes je technika polymerázové řetězové reakce účinná a slibná.PCR pro syfilis umožňuje získat výsledky během několika hodin a v materiálu odebraném pro diagnostiku může být přítomno alespoň několik patogenů.
Rýže. 21. PCR pro syfilis dokáže detekovat DNA nebo její fragmenty z Treponema pallidum.
Citlivost této výzkumné metody závisí na přítomnosti Treponema pallidum v biologickém materiálu a dosahuje 98,6 %. Specifičnost tohoto testu do značné míry závisí na správné volbě cíle pro amplifikaci během diagnózy a dosahuje 100 %.
Zároveň vzhledem k nedostatečně prostudovaným srovnávacím charakteristikám senzitivity a specificity přímých metod diagnostiky syfilis a PCR nebyla tato vyšetřovací metoda v Ruské federaci pro diagnostiku onemocnění dosud schválena.
PCR pro syfilis je povoleno provádět pouze v některých případech jako další metoda pro diagnostiku vrozené syfilis, neurosyfilis, pokud je obtížné diagnostikovat syfilis pomocí sérologických metod u pacientů s HIV.
Rýže. 22. Detekce DNA Treponema pallidum pomocí PCR indikuje buď přítomnost životaschopných bakterií, nebo zbytky mrtvých bakterií, které však obsahují jednotlivé úseky chromozomální DNA schopné tvořit další kopie.
