Badanie na kiłę jest jednym z najczęstszych badań laboratoryjnych. Testy na kiłę są szeroko stosowane podczas badań profilaktycznych. Za pomocą mikroskopii identyfikuje się czynnik sprawczy kiły - Treponema pallidum.Na podstawie reakcji serologicznych potwierdza się rozpoznanie kiły, ustala się rozpoznanie kiły utajonej, monitoruje skuteczność leczenia i określa wyleczenie pacjentów.
Rozpoznanie kiły ustala się na podstawie danych klinicznych, wykrycia patogenów kiły w próbkach materiału i potwierdzenia rozpoznania metodami badań serologicznych. Objawy kiły są liczne i różnorodne, dlatego chorobę diagnozują lekarze różnych specjalności. Diagnostykę różnicową kiły pierwotnej przeprowadza się w przypadku wielu chorób.
Ryż. 1. Na zdjęciu głównym objawem kiły jest wrzód.
Przeciwciała przeciwko Treponema pallidum i diagnostyka serologiczna
Po zakażeniu kiłą w organizmie pacjenta powstają przeciwciała. Diagnostyka serologiczna pomaga lekarzowi zbadać dynamikę powstawania przeciwciał w organizmie pacjenta chorego na kiłę w początkowej fazie choroby, w okresie leczenia i po jego zakończeniu, aby rozwiązać problem nawrotu choroby u pacjenta lub ponowna infekcja (reinfekcja), w celu diagnozowania kiły w masowych schorzeniach.
Przeciwciała przeciwko Treponema pallidum IgM
Przeciwciała IgM są produkowane jako pierwsze po zakażeniu. Zaczynają być wykrywane za pomocą reakcji serologicznych od drugiego tygodnia po zakażeniu. Po 6-9 tygodniach choroby ich liczba osiąga maksimum. Jeśli pacjent nie jest leczony, przeciwciała znikają po sześciu miesiącach. Przeciwciała IgM zanikają po 1-2 miesiącach. po leczeniu kiły wczesnej, po 3 - 6 miesiącach. - po leczeniu kiły późnej. Jeśli zostanie zarejestrowany ich wzrost, jest to oznaką nawrotu kiły lub wskazuje na ponowną infekcję. Cząsteczki IgM są duże i nie przedostają się przez łożysko do płodu.
Przeciwciała przeciwko Treponema pallidum IgG
Przeciwciała immunoglobulinowe IgG pojawiają się pod koniec pierwszego miesiąca (4 tygodnia) od momentu zakażenia. Ich miano jest wyższe niż miano IgM. IgG utrzymują się dość długo po leczeniu.
Nieswoiste przeciwciała
Istnieje wiele reakcji serologicznych. Wyjaśnia to wielość antygenów Treponema pallidum. W surowicy krwi chorego na różnych etapach kiły, oprócz specyficznych, powstają pewne nieswoiste przeciwciała - aglutyniny, wiążące dopełniacz, immobilizyny, przeciwciała powodujące fluorescencję immunologiczną, precypityny itp. Reakcje serologiczne w celu wykrycia nieswoistych przeciwciał mają względną specyficzność, dlatego też, aby uniknąć błędów diagnostycznych, należy zastosować nie jedną, ale zespół reakcji serologicznych (SRR).
Fałszywie pozytywne testy na kiłę
Charakterystyczną cechą testów innych niż krętkowe jest otrzymywanie fałszywie dodatnich reakcji. Przeciwciała-reaginy, które powstają we krwi ludzkiej przeciwko antygenowi kardiolipiny, występują nie tylko w kile, ale także w innych chorobach: kolagenozie, zapaleniu wątroby, chorobach nerek, tyreotoksykozie, nowotworach, chorobach zakaźnych (trąd, gruźlica, bruceloza, malaria, tyfus, szkarlatyna), w czasie ciąży i cykli menstruacyjnych, podczas spożywania tłustych potraw i alkoholu. Zauważono, że liczba reakcji fałszywie dodatnich wzrasta wraz z wiekiem.
Ryż. 2. Zdjęcie przedstawia kiłę pierwotną u kobiet.
Diagnostyka laboratoryjna kiły za pomocą testów serologicznych
Testy serologiczne na kiłę dzielą się na krętkowe i niekrętkowe.
1. Testy inne niż krętkowe
Antygenem stosowanym w tej grupie testów jest antygen kardiolipinowy. Najliczniej występują antygeny lipidowe patogenów kiły. Stanowią 1/3 suchej masy komórki. Za pomocą testów innych niż krętkowe wykrywa się przeciwciała odczynowe wytwarzane przeciwko antygenowi kardiolipiny. Do tej grupy zalicza się test wiązania dopełniacza (FFR), test mikroprecypitacji (MPR), szybki test odczynu osocza (RPR) itp. Za pomocą testów niekrętkowych przeprowadza się pierwotne badania przesiewowe w kierunku kiły (badanie grup populacji) i możliwość uzyskanie wyników w formie ilościowej pozwala na wykorzystanie tych badań do monitorowania skuteczności leczenia. Pozytywne wyniki testów innych niż krętkowe należy potwierdzić testami krętkowymi. Charakterystyczną cechą testów innych niż krętkowe jest otrzymywanie fałszywie dodatnich reakcji.
2. Testy krętkowe
W testach krętkowych wykorzystuje się antygeny pochodzenia krętkowego wyizolowane z hodowli Treponema pallidum. Za ich pomocą potwierdzają się pozytywne wyniki testów innych niż krętkowe. Do grupy tej zalicza się: RSKtrep – reakcja wiązania dopełniacza, RIF – reakcja immunofluorescencyjna i jej modyfikacje, RIT, RIBT – reakcja unieruchomienia Treponema pallidum, RPHA – reakcja hemaglutynacji biernej, ELISA – enzymatyczny test immunoabsorpcyjny.
3. Testy na kiłę z wykorzystaniem rekombinowanych antygenów
Antygeny dla tej grupy testów otrzymywane są metodą inżynierii genetycznej i wykorzystywane są w reakcjach RPGA i ELISA, w analizach immunoblottingu (IB) i analizach immunochromatograficznych.
Ryż. 3. Do rozpoznania kiły stosuje się zestaw testów serologicznych.
Diagnostyka kiły za pomocą testów innych niż krętkowe
Do wykrycia kiły stosuje się testy inne niż krętkowe lub kompleks reakcji serologicznych (SSR). Diagnostykę serologiczną stosuje się od 5 tygodnia od momentu zakażenia lub od 2-3 tygodni po pojawieniu się wrzodu. Przeciwciała wykrywa się u prawie wszystkich pacjentów ze świeżą kiłą pierwotną, wtórną i nawracającą. Reakcje serologiczne są dodatnie u 70–80% chorych na kiłę trzeciorzędową czynną, w 50–60% przypadków u chorych na kiłę utajoną trzeciorzędową.
Testy serologiczne z wykorzystaniem testów innych niż krętkowe mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie.
Reakcja wiązania dopełniacza (karta RSK, KSK z KA, reakcja Wassermana)
Reakcja Wassermana (RW, РВ), wynaleziona przez A. Wassermana ponad 100 lat temu, przeszła dziś wiele zmian, jednak w hołdzie tradycji zachowała swoją nazwę do dziś. Reakcja wiązania dopełniacza przy użyciu antygenu kardiolipinowego ma na celu nie tylko wykrycie przeciwciał, ale jest również przeprowadzana ilościowo – przy różnych rozcieńczeniach surowicy, co pozwala na wykorzystanie jej do monitorowania skuteczności leczenia. Negatywną stroną tego typu badań jest niska czułość i swoistość, uzyskiwanie wyników fałszywie dodatnich.
Istota reakcji Wassermana jest następująca: antygeny wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji Wassermana, w przypadku obecności w ludzkiej krwi przeciwciał przeciwko czynnikom wywołującym kiłę, wiążą się z nimi poprzez komplement i wytrącają się. Intensywność reakcji jest oznaczona znakiem (+).Reakcja może być negatywna (-) - brak osadu, wątpliwa (mały osad lub +), słabo pozytywna (++), pozytywna (+++) i silnie pozytywna (++++).
Zmodyfikowana reakcja Wassermana, reakcja Kolmera, jest bardziej czuła. Za jego pomocą wykrywa się przeciwciała w surowicy, w której reakcja Wassermana dała wynik negatywny.
W przypadku reakcji ostro dodatnich przeprowadza się ilościowe oznaczenie odczynników, do których stosuje się surowicę w rozcieńczeniach od 1:10 do 1:320, co pozwala na wykorzystanie tego typu badań do monitorowania skuteczności leczenia. Przykładowo spadek miana przeciwciał i późniejsza ich seronegatywność (uzyskanie wyników ujemnych) świadczy o skutecznym wyleczeniu choroby.
Ryż. 5. Badanie krwi na kiłę – reakcja Wassermana.
Reakcja mikrostrącania (MPR)
Mikroreakcja strąceniowa wykorzystywana jest do masowych badań określonych grup populacji, diagnostyki kiły i monitorowania skuteczności leczenia. Do przeprowadzenia tego typu badań wymagana jest niewielka ilość materiału badawczego. Mikroreakcja wytrącania opiera się na reakcji immunologicznej antygen-przeciwciało. Jeżeli w surowicy krwi pacjenta obecne są przeciwciała, kompleks antygen-przeciwciało wytrąca się, tworząc płatki. Reakcję prowadzi się w dołkach specjalnej płytki szklanej. Ocenia się to na podstawie intensywności osadu i wielkości płatków w (+) jako reakcję Wassermana. Nie stosuje się go przy badaniu kobiet w ciąży, dawców i monitorowaniu skuteczności leczenia. VDRL i RPR to rodzaje mikroreakcji.
Ryż. 6. Rodzaj reakcji wytrącania w kropli na szkle.
Ryż. 7. Badanie krwi na kiłę - reakcja mikroprecypitacji.
Ryż. 8.Zestaw do szybkiego oznaczania odczynów osocza (test RPR na kiłę).
Wszystkie pozytywne testy uzyskane podczas nieswoistych reakcji serologicznych wymagają potwierdzenia reakcjami specyficznymi – testami krętkowymi.
Podczas przeprowadzania testów krętkowych stosuje się antygeny pochodzenia krętkowego. Ich negatywną stroną jest niemożność wykorzystania ich do monitorowania skuteczności leczenia, uzyskania pozytywnych wyników w krętkach i krętkach niewenerycznych oraz uzyskania fałszywie pozytywnych wyników w chorobach onkologicznych, trądzie i niektórych patologiach endokrynologicznych. Testy takie jak RPGA, ELISA i RIF pozostają pozytywne przez wiele lat po wyleczeniu kiły, a w niektórych przypadkach przez całe życie.
RIBT i RIF to najbardziej specyficzne reakcje serologiczne stosowane w diagnostyce kiły. Umożliwiają rozróżnienie reakcji fałszywie dodatnich i identyfikację późnych postaci kiły, które występują przy reakcjach ujemnych. Za pomocą RIBT rozpoznaje się fałszywie dodatnie reakcje u kobiet w ciąży, gdy konieczne jest rozwiązanie problemu infekcji dziecka.
Istota reakcji polega na tym, że przeciwciała znajdujące się w surowicy krwi pacjenta unieruchamiają Treponema pallidum. Reakcję uważa się za negatywną, gdy unieruchomionych jest do 20% patogenów, słabo pozytywna - 21 - 50%, pozytywna - 50 - 100%. RIBT czasami daje fałszywie pozytywne wyniki.Test jest skomplikowany i pracochłonny, jednak niezbędny w diagnostyce różnicowej utajonych postaci choroby i fałszywie dodatnich wyników reakcji serologicznych, także u kobiet w ciąży. RIBT daje 100% wynik pozytywny w przypadku kiły wtórnej, wczesnej i późnej, w 94 - 100% przypadków - w przypadku pozostałych postaci kiły.
Reakcja immunofluorescencyjna (RIF)
Istota reakcji polega na tym, że treponema pallidum (antygeny) w połączeniu z przeciwciałami znakowanymi fluorochromami emitują w mikroskopie fluorescencyjnym żółto-zieloną poświatę. Wynik jest oceniany ze znakiem (+). Za pomocą RIF wykrywa się immunoglobuliny klasy A. Reakcja immunofluorescencyjna staje się dodatnia wcześniej niż reakcja Wassermana. Zawsze daje wynik dodatni w przypadku kiły wtórnej i utajonej, w 95 - 100% przypadków jest dodatni w przypadku kiły trzeciorzędowej i wrodzonej. Technika prowadzenia tego typu badań jest prostsza niż RIBT, ale nie można zastąpić RIF RIBT, ponieważ reakcja ta jest gorsza pod względem specyficzności od RIBT. RIF-10 (modyfikacja RIF) jest bardziej czuły, RIF-200 i RIF-abs są bardziej specyficzne.
Ryż. 9. Badanie krwi na kiłę – reakcja immunofluorescencyjna (RIF).
Istota reakcji polega na tym, że treponema pallidum, uwrażliwiony surowicą pacjenta, w obecności dopełniacza, przylega do powierzchni czerwonych krwinek. Powstałe kompleksy wytrącają się podczas wirowania. Czułość i swoistość tego testu są zbliżone do RIF i RIBT.
Test immunoenzymatyczny na kiłę (ELISA)
Za pomocą testu ELISA oznacza się immunoglobuliny klasy M i G. Technika IgM-ELISA może być stosowana jako badanie przesiewowe i potwierdzające.Czułość testu ELISA i jego swoistość są podobne do RIF. W przypadku kiły wynik testu ELISA daje wynik pozytywny już od trzeciego miesiąca zakażenia i pozostaje dodatni przez dość długi czas (czasem przez całe życie).
RPHA opiera się na zdolności czerwonych krwinek, na których zaadsorbowane są antygeny krętka bladego, do sklejania się (hemaglutynacja) w obecności surowicy pacjenta. RPGA służy do diagnozowania wszystkich postaci kiły, w tym utajonej. W przypadku stosowania antygenu wysokiej jakości ten typ reakcji serologicznej przewyższa wszystkie inne testy pod względem swoistości i czułości.
Ryż. 11. RPGA służy do diagnozowania wszystkich postaci kiły.
Ryż. 12. Test na kiłę - bierna (pośrednia) reakcja hemaglutynacji (schemat).
Ryż. 13. Pojawienie się odwróconego parasola zajmującego całe dno probówki wskazuje na reakcję pozytywną. W przypadku, gdy czerwone krwinki opadną w kolumnę („przycisk”) pośrodku dna probówki, oznacza to reakcję ujemną.
Oprócz diagnostyki serologicznej ważną rolę odgrywa metoda wykrywania Treponema pallidum (diagnostyka mikrobiologiczna), szczególnie w okresie kiły seronegatywnej, kiedy we krwi nadal nie ma przeciwciał, ale są już pierwsze objawy świeżej kiły pierwotnej ( archiwsta).
Materiałem biologicznym do badań jest wydzielina z powierzchni twardych wrzodów (wrzodów), zawartość kiły krostkowej, grudki płaczące i nadżerkowe, nakłucia zakażonych węzłów chłonnych, płyn mózgowo-rdzeniowy i płyn owodniowy do PCR – krew;
Najlepszą metodą wykrywania patogenów kiły jest badanie materiału biologicznego pod mikroskopem z ciemnym polem. Technika ta pozwala zobaczyć treponema pallidum w stanie żywym, zbadać jego cechy strukturalne i ruch oraz odróżnić patogeny chorobotwórcze od saprofitów.
Ryż. 15. Analiza w kierunku kiły – mikroskopia w ciemnym polu.
Ryż. 16. Podczas badania suchych rozmazów stosuje się barwienie Romanowskiego-Giemsy. Jasne krętki zmieniają kolor na różowy, wszystkie inne typy krętków zmieniają kolor na fioletowy.
Wykrycie Treponema pallidum za pomocą mikroskopii w ciemnym polu jest bezwzględnym kryterium ostatecznej diagnozy kiły.
Ryż. 17. Do identyfikacji bakterii stosuje się reakcję immunofluorescencyjną (RIF) - test krętkowy. Specyficzny kompleks antygen-przeciwciało w połączeniu ze swoistą surowicą znakowaną fluorochromem, w świetle mikroskopu fluorescencyjnego nadaje bakteriom zielonkawy blask.
Ryż. 18. Czynniki wywołujące kiłę są wyraźnie widoczne w rozmazach sporządzonych metodą Levaditi (impregnacja srebrem). Blady treponema ma ciemny kolor na tle żółtego koloru komórek zakażonych tkanek.
Ryż. 19. Czynnik sprawczy kiły w wielokrotnym powiększeniu.
Ryż. 20. Na zdjęciu kolonia Treponema pallidum. Uzyskanie hodowli bakteryjnej jest trudne. Praktycznie nie rosną na sztucznych pożywkach. Na podłożach zawierających surowicę końską i króliczą kolonie pojawiają się w dniach 3–9.
Obecnie technika reakcji łańcuchowej polimerazy jest skuteczna i obiecująca.PCR w kierunku kiły pozwala uzyskać wynik w ciągu kilku godzin, a w materiale pobranym do diagnozy może znajdować się co najmniej kilka patogenów.
Ryż. 21. PCR w kierunku kiły umożliwia wykrycie DNA lub jego fragmentów Treponema pallidum.
Czułość tej metody badawczej zależy od obecności Treponema pallidum w materiale biologicznym i sięga 98,6%. Specyficzność tego testu w dużej mierze zależy od prawidłowego wyboru celu amplifikacji w trakcie diagnozy i sięga 100%.
Jednocześnie ze względu na niedostatecznie zbadane cechy porównawcze czułości i swoistości bezpośrednich metod diagnozowania kiły i PCR, ta metoda badania w Federacji Rosyjskiej do diagnozowania choroby nie została jeszcze zatwierdzona.
PCR na kiłę można przeprowadzić tylko w niektórych przypadkach, jako dodatkową metodę diagnozowania kiły wrodzonej, kiły nerwowej, jeśli trudno jest zdiagnozować kiłę metodami serologicznymi u pacjentów z HIV.
Ryż. 22. Wykrycie DNA Treponema pallidum metodą PCR wskazuje na obecność żywych bakterii lub pozostałości bakterii martwych, ale zawierających pojedyncze odcinki chromosomalnego DNA zdolne do tworzenia dodatkowych kopii.
